编者按：中国猪业已到了生死存亡的危机关口！生存还是毁灭？这是摆在所有养猪人面前，摆在所有饲料厂、动保厂、经销商面前的严峻考验。《农财宝典》新牧网正联合政府、协会、全国知名畜牧企业及一切有志于防控非洲猪瘟的业内机构与行业人士一起，发起“防瘟微创新”公益助农行动！ 目前已有近百家知名农牧企业加入“防瘟微创新”行动，一起贡献出自己的智慧。今天我们要介绍的是河南创源生物技术有限公司提出的防瘟微创新方案。 “方舟计划”——非洲猪瘟疫情下开展种猪资源组织冷冻技术保种的探讨
作者：河南创源生物技术有限公司 李爱民
非洲猪瘟于1921年在肯尼亚首次发现，近百年来，已有60个国家先后发生非洲猪瘟疫情。截至目前，全球已有罗马尼亚、匈牙利、波兰、南非等15个国家发生4400多起疫情，部分国家呈现大暴发、大流行态势。在60个已发生过非洲猪瘟疫情的国家中，只有13个国家根除了疫情，根除时间多为5至36年。俄罗斯从2007年首次发生非洲猪瘟至今已经有12年，共发生疫情超过1000起(其中2018年已发生100多起)，有17个地方品种灭群，目前仍没有得到有效控制。
中国是养猪大国，养猪量占到全世界一半以上；中国也是世界猪资源品种最为丰富的国家。全国范围内国家级核心育种猪场（99家）、国家级地方品种猪保种场（畜禽遗传资源保护区）60个、省级及其他地方品种猪保种场、一级种猪场、省级地方品种猪保种场（资源场）、核心种公猪站、其他高价值种猪资源等数量较多，数以千计。种猪资源容易受到洪水、风灾、火灾、高致死性传染病等不确定因素威胁，极端情况会有灭群的可能。
一、 非洲猪瘟可能对我国养猪业造成严重影响：
1. 非洲猪瘟传播快速， 病死率高，群体一旦感染即可导致大面积死亡；
2. 国家政策严控，群体一旦感染即被要求全群扑杀；
3. 中国独有地方良种猪，一旦感染非洲猪瘟，可能导致群体灭绝，永久的失去了宝贵的种质资源，损失不可估量；
4. 育种过程很漫长，但一旦感染非洲猪瘟，多年精心培育的群体可能顷刻间化为乌有；
5. 国外引种途径中断，种猪企业惜售，活猪运输风险剧增，一旦感染非洲猪瘟，重建种群时间规划和工作量远高于预期；
6. 核心种群若遭遇非洲猪瘟，会影响到商品群扩增计划，在规模化发展的未来黄金十年，不利于有效参与行业竞争，可能丧失发展良机。
二、 组织冷冻保存技术可以降低灭群风险
1. 参照国际经验：
从西班牙、俄罗斯和海地等国应对非洲猪瘟的成功经验和失败教训，我们可以得出结论：
1.1. 非洲猪瘟完全可以得到根除；
1.2. 有效的技术支持（如血清学猪群检测）和全国统筹生物防控是有效抵御非洲猪瘟的措施，盲目全面捕杀不是明智之举；海地方案（盲目群体捕杀+外种猪补栏计划）是很好的反面教材。
2. 其他降低损失技术方案：
在非洲猪瘟重大疫情下，在没有可靠的非洲猪瘟疫苗研发出来之前，我们可以采用多种技术手段直接用来抵御非洲猪瘟，降低群体损失：
2.1. 病原检测+精液冷冻技术
目前，非洲猪瘟快速检测试剂盒已经被研发出来，可以保证数小时快速得到结果。
精液冷冻技术的优势：依据检测结果，借助精液冻存技术保存公猪精液，可以保证良种基因长时间保存，免受非洲猪瘟影响。目前，已经有公司进行产业化推广，商业化的冻存精液每头份150-200元。
精液冷冻技术的缺点：只能保存种公猪精液，且对于良种后代的贡献率为50%。对于良种后代另外50%贡献率的母猪，因为卵子和胚胎不能商业化冻存而得不到保护。单纯精液冷冻技术无法保证一个良种群体基因的完整性。
2.2. 病原检测+组织冷冻技术
组织冻存技术是新型冷冻生物学技术，仅需花费几百元就可以简单、快速完成任意日龄、任意性别种猪组织的保存，借助体细胞克隆技术不但可以100%完整保存种猪个体基因，更可以100%完整保存种猪群体基因。
组织冻存技术的优势：依据病原快速检测结果，利用组织冻存技术，可以极低的成本、快速完成整个种猪群体的保种，可以在将来任意时间通过体细胞克隆技术快速恢复原来群体，可以完全降低非洲猪瘟的灭群风险。
组织冻存技术的缺点：可能会有极少比例的组织冻存失败（即不能有效复苏建立细胞系），若良种猪已经不存在，会造成良种基因的丢失。
2.3. 病原检测+细胞冷冻技术
细胞冷冻技术是最为常用的保种技术，具备组织冻存技术的所有优点，但美中不足之处为，保存成本比较昂贵，每头份需要三千元左右，是组织冷冻的4-5倍。
细胞冷冻技术的优势：可以在一周的时间内知道细胞系建立成功与否，方便再次采样进行补救。
细胞冷冻技术的缺点：相对于组织冻存技术成本较高。
三、 新型组织冷冻保存技术概况
1. 技术基本概况。
组织冻存技术，是直接将组织无菌条件剪碎后加入抗冻剂，然后置于-196℃液氮中低温保存，可以使组织暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，待需要的时候再复苏并培养分离出细胞用于实验。由于猪个体、品种和年龄差异性，在过去，一次性从冷冻组织成功建立细胞系的效率非常低。通过新的技术改进，即使用最新的组织冷冻保存技术，冷冻组织已经可以达到接近100%的复苏后建系成功率。利用新型组织冻存技术，通过体细胞克隆技术已经成功克隆很多种猪。经过全国科研工作者二十多年的努力，体细胞克隆技术已经获得国家科技进步二等奖，进入成果转化与技术推广阶段，在畜牧业发达国家，如美国，也已经商业化应用多年，对于良种培育起到了巨大的推动作用。
目前，在我国，猪体细胞克隆技术已经完全达到产业化应用水平，关键技术指标也已经达到了世界领先水平，仅需种猪国外引种的1/3-1/4成本即可短时间内获得大量优秀种猪，可以在很大程度上解决疫情威胁、国外引种、良种基因扩繁和专门化品系培育等带来的困扰与烦恼。
2. 新型组织冷冻保存技术特点
其主要技术特点就是，相对于精子和卵子保存，由于其富含动物正常2倍体体细胞，可以100%保存个体的基因，且简单、快速、价格低廉和高效。适度地保存一定量的组织，可以防止因各种意外事件而使个体或群体消失，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用组织冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送种猪基因资源。
借助体细胞克隆技术不但可以100%完整保存种猪个体基因，更可以100%完整保存种猪群体基因，因此，价格低廉、高效的新型组织冻存策略，是一定程度上的 “保险”行为。
3. 新型组织冻存技术的可行性
3.1. 操作简便，猪场人员，可以在1分钟内熟练掌握组织取样操作；
3.2. 实用性强，100%保存种猪基因首选；
3.3. 成本低廉，猪头均仅需花费几百元，即可保证两年内优质基因资源安全无忧；
3.4. 使用方便，解冻后最长（短）2周内即可投入使用；
3.5. 无年龄限制，任何日龄的种猪均适用本方案；
3.6. 效率高，保存成功率可以达到接近100%，结合体细胞克隆技术，可以用来挽救或扩繁优秀种猪群体。
4. 技术示范推广情况。
新型组织冷冻技术结合成熟的体细胞克隆技术，已经在小范围内进行测试、示范。新型组织冻存技术可以达到接近100%的冻存复苏率，进行体细胞克隆后，关键技术指标已经达到国内领先、世界一流水平，如代孕母猪怀孕率可以达到80%以上，窝产仔数可以达到6-8头，窝断奶仔猪数可以达到5头。该技术已经具备了更大范围进行示范与推广的条件。
四、 技术要点
组织冻存方案操作非常简单易行，仅包括两个阶段六个步骤和要点，具体如下：
1. 猪场阶段，由猪场操作：
1.1. 筛选种猪，记录种猪信息，采样瓶标记种猪耳号、采样日期；
1.2. 常见消毒剂消毒耳部组织，无菌剪取组织并放入装满生理盐水无菌采样瓶密封；
1.3. 样本运输。
2. 实验室阶段：
2.1. 登记种猪信息；
2.2. 对猪耳部组织高效消毒灭菌处理，组织样本冷冻前预处理；
2.3. 加入组织冻存液，启动冷冻程序，最后转入液氮罐专罐保存。
五、 注意事项
1. 筛选出的种猪信息登记一定要完整，电子版、纸质版和采样瓶的编号要核对无误。
2. 采样时耳部消毒要严格，尽量接近无菌条件。
3. 运输条件严格按照技术要求4℃运输，防止冷冻。
六、 效益分析
新型组织冻存技术可以带来以下诸多方面的巨大益处：
1. 成本投入最低，用最低的花费可以100%保存良种基因；
2. 猪群延续性增强，可以随时从组织银行提取优良基因用于育种，良种零丢失；
3. 复群速度快，结合体细胞克隆技术，仅数月时间即可使数千头规模猪场完整复群；
4. 结合体细胞克隆技术，就地胚胎移植，就地生猪，可以完全避开种猪的全国调运的疫病风险；
5. 结合克隆技术和独创“病原净化”技术，可以同步净化绝大部分病原微生物（如蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和猪瘟等），如果配套合适硬件，可生产SPF级种猪，确保猪场安全、健康生产。
综上所述，在目前非洲猪瘟疫情下，活体保种圈舍设施、饲养管理费用高昂，时刻受到疾病和传染性疾病和重大疫情的困扰。在做好生物安全措施的同时，结合新型组织冷冻技术，是更为完整、安全和高效的保种策略。
